专家点评：厌氧氨氧化菌的富集培养是限制该工艺的关键因素，文章通过对照试验考察了铁离子对厌氧氨氧化污泥富集培养的影响，并采用定量PCR及16S rRNA高通量测序技术分析其机理，研究结果对厌氧氨氧化污泥的富集培养及工艺的启动具有参考价值和指导意义。该文试验数据充分，理论分析合理，撰写规范，较好地表达了研究过程和结果，研究成果具有理论意义和实用价值。
本研究通过对照试验考察了铁离子对厌氧氨氧化污泥富集培养的影响，并采用荧光定量PCR及16S rRNA高通量测序技术从微生物生态学解析其机理，研究结果对厌氧氨氧化污泥的富集培养及工艺启动具有参考价值和指导意义。
1材料与方法
1.1试验装置与运行条件
试验采用小试规模厌氧颗粒污泥膨胀床反应器(expanded granular sludge bed, EGSB)，由有机玻璃制作，有效容积为0.8 L，外覆锡纸以隔绝光的影响。反应器运行温度通过恒温循环水槽维持在35 ℃，进水pH值用0.1 mmol/L盐酸调节为6.6~6.8，以保证Fe(Ⅲ)的溶解;本试验采用连续流，水力停留时间(HRT)为24 h，试验装置如图1所示。
1.2接种污泥与模拟废水
试验所用接种污泥取自南京某市政污水厂氧化沟缺氧段，为棕黄色絮状污泥。反应器接种污泥量为20 g/L，接种前用pH值= 7.2的磷酸盐缓冲液冲洗三次，以洗去残余物质。模拟废水以自来水配置，组分为：(NH4)2SO4 (按需配制)、NaNO2 (按需配制)、KH2PO410 mg/L、CaCl2˙2H2O 5.6 mg/L、MgSO4˙7H2O 300 mg/L、KHCO3 500 mg/L、EDTA 25 mg/L、微量元素浓缩液Ⅰ 1.25 mL/L、微量元素浓缩液Ⅱ (按需配制)。微量元素浓缩液Ⅰ组分为：FeSO4 0.625 mL/L、H3BO4 0.0175 mL/L、MnCl2˙4H2O1.2375 mL/L、CuSO4˙5H2O 0.3125 mL/L、ZnSO4˙7H2O 0.5375 mL/L、NiCl2˙6H2O 0.2375 mL/L、NaSeO4˙10H2O 0.2625 mL/L、NaMoO4˙2H2O 0.275 mL/L。微量元素浓缩液Ⅱ：FeCl3 (按需配制)，R1为控制组，模拟废水中不添加微量元素浓度液Ⅱ;而试验组R2、R3中添加微量元素浓缩液Ⅱ并控制Fe(Ⅲ)浓度分别为0.04、0.08 mmol/L。模拟废水预曝高纯氮气(> 99.5%)至溶解氧浓度(DO)低于0.5 mg/L，再泵入反应器中。
1.3常规指标分析方法
反应器出水定期采样，经0.22 μm滤膜过滤后测定，分析测定方法参考国家标准。NH4+-N采用水杨酸分光光度法;NO2--N采用N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法;NO3--N采用酚二磺酸分光光度法;Fe(Ⅲ)采用邻菲啰啉光光度法;溶解氧(DO)以便携式溶解氧仪测定，pH值由pH计测定。
1.4污泥粒径分析
从反应器中取一定量污泥至50 mL离心管中，置于激光粒度仪(Mastersizer 3000，英国马尔文仪器有限公司)中检测。样品充分混匀后，以水为分散剂进行分析测试，并使用机器配置的软件进行记录，使用一次性塑料滴灌吸取搅拌均匀的样品，污泥样加至遮光度在10%~15%时进行测试。单一样品重复测定三次，以降低误差。
1.5实时荧光定量PCR分析
污泥样品采用FastDNA SPIN Kit for soil试剂盒提取污泥DNA，而后用NanoDrop 2000超微量紫外分光光度计定量，采用SYBR® Green染料法进行定量PCR分析。选取目标基因包括：细菌16S rRNA基因、厌氧氨氧化菌16S rRNA基因及部分氮素转化功能基因，以含有目标基因的质粒标准品建立标准曲线(R2 > 0.999)。扩增体系为25 μL，含12.5 μL 2 × SYBR® Green PCR Master Mix(Vazyme，中国)，2 μL模板DNA(20 ng/μL)，正反引物各0.2 μL，10.1 μL无菌超纯水;扩增程序在荧光定量PCR仪AB7500(Life Technologies, 美国)进行，每个样品做三个平行，具体参数如表1所示。
表1 目标基因的引物序列及退火温度
1.616S rRNA高通量测序分析
16S rRNA高通量测序分析基于Illumina Miseq测序平台，具体步骤包括DNA提取、PCR扩增、产物验证及纯化、测序及结果分析。DNA提取见1.5，PCR扩增采用细菌通用引物，引物序列为：正向引物(5’-AGAGTTTGATYMTGGCTCAG-3’)，反向引物(5’-TGCTGCCTCCCGTAGGAGT-3’);扩增体系为50 μL，含5 μL 10×PCR Buffer (TaKaRa，日本)、0.25 μL Ex Taq DNA聚合酶、4 μL MgCl2、4 μL DNTP Mixture、2 μL DNA模板(20 ng/μL)、正反引物各1 μL，无菌超纯水若干。扩增反应于Veriti PCR仪(Life Technologies，美国)进行，扩增程序为：预变性98 ℃/5 min，扩增循环20次(变性98 ℃/30 s，退火50 ℃/30 s，延伸72 ℃/40 s)，延伸72 ℃/10 min。扩增产物经2%的琼脂糖凝胶电泳验证，经E.Z.N.A.TM Cycle-Pure Kit试剂盒纯化后，送至江苏中宜金大分析检测有限公司进行测序分析。测序数据使用Sickle和Mothur程序降噪处理，而后用RDP classifier对序列分类，使用Heml程序绘制热图。
2结果与讨论
2.1反应器运行性
能厌氧氨氧化污泥富集培养过程中，为考察铁离子的影响，反应器保持同步容积氮负荷提升，直至运行稳定。反应器R1、R2、R3进出水氮素指标、容积氮负荷及氮去除速率如图2所示。
图2 铁离子对厌氧氨氧化污泥富集培养过程中脱氮效能的影响
由图2可知，富集培养初期(0~4 d)各反应器均出现菌体自溶现象，表现为出水NH4+-N浓度高于进水。由于进水中无有机碳源，且溶解氧浓度严格限制，导致部分微生物难以适应无机环境而自溶。在菌体自溶阶段，反应器中存在强烈的内源反硝化作用，出水NO2--N及NO3--N浓度几乎为0;此时反应器污泥颜色由黄棕变黑，并伴有明显的减量。
随着菌体自溶作用的减弱，反应器进入活性迟滞阶段，表现出微弱的厌氧氨氧化作用。在此阶段(5~38 d)，进水NH4+-N和NO2--N保持在45.1 mg/L和61.1 mg/L，各反应器运行并未表现出明显差异。各反应器中出水NH4+-N浓度为24.6~42.6 mg/L，平均NH4+-N去除率为21.8%~26.7%，反应器出水NO2--N浓度较低，表明反应器中仍存在一定的反硝化作用。在此阶段，各反应器逐渐适应环境，反硝化作用减弱，出水水质变化特征类似。
随着反硝化功能的减弱，各反应器中厌氧氨氧化作用不断增强，成为主要脱氮途径，为活性提高阶段。在此过程，各反应器进水容积氮负荷同步提升，由于铁离子的添加，反应器表现出不同的容积氮负荷耐受能力。反应器R1活性提高阶段为39~88 d，容积氮负荷由132.6 mg/(L˙d)提升至489.4 mg/(L˙d);R2在活性提高阶段(39~100 d)容积氮负荷由132.6 mg/(L˙d)提升至580.9 mg/(L˙d);R3活性提高阶段为39~112 d，容积氮负荷由132.6 mg/(L˙d)提升至696.6 mg/(L˙d)。容积氮负荷提升量由高到低为R3 > R2 > R1;此外，活性提高阶段R1、R2、R3中平均总氮去除率分别为82.9%、84.2%、85.3%，试验组R2、R3整体脱氮效率略高于R1。
在厌氧氨养护污泥富集培养中，由于厌氧氨氧化菌生长缓慢，反应器容积负荷有限。许多研究证明了高氮素基质对厌氧氨氧化菌的抑制作用。Strous等研究表明亚硝酸盐浓度达到100 mg/L，即可强烈抑制厌氧氨氧化菌活性;本研究以出水亚硝酸盐浓度高于100 mg/L作为反应器超过可承受负荷并失稳的依据。对照组R1在运行90 d时，容积氮负荷超出反应器承受极限，出水NH4+-N和NO2--N浓度急剧升高，类似失稳现象也出现在试验组R2(第102 d)、R3(第114 d)。反应器失稳后，降低进水基质氮浓度，同时加大回流比以解除基质自抑制;由于EGSB反应器抗冲击负荷能力强，反应器很快恢复稳定运行。稳定阶段反应器运行状况如表2所示。Chen等通过批次试验证明了3.68 mg/L的铁离子添加下，比厌氧氨氧化活性可提高533.2%;长期试验证明，铁离子的添加，相较于控制组，提升了19.5%的反应器容积负荷，与本研究结果类似。
表2 稳定阶段反应器运行状况
2.2污泥粒径分布
本研究采用EGSB反应器培养厌氧氨氧化污泥，接种污泥为絮状反硝化污泥，取接种污泥及130 d污泥样品，用激光粒度仪分析其粒径，结果如图3所示。
富集培养130 d时，表观观察发现污泥呈颗粒化特征。激光粒度分析结果显示，反应器R1、R2、R3中污泥样品平均粒径分别为796、908 μm和1040 μm，试验组R2、R3中污泥粒径较高。据DLVO理论，当负载电性相同的电荷时，由于细菌个体之间静电斥力的存在，不利于颗粒状富集培养物的形成。添加多价阳离子(Ca2+、Mg2+、Fe3+、Al3+等)，可以减少细菌间的静电斥力，通过压缩双电层促进细胞聚集，进而强化颗粒污泥富集。本试验中，铁离子的添加强化了厌氧氨氧化污泥的颗粒化;除减少细菌间静电斥力作用外，铁离子还是酶的常见活性剂，提高微生物代谢活性，促进微生物生长，加速厌氧氨氧化污泥的颗粒化。
2.3功能基因及厌氧氨氧化菌丰度变化
定量PCR结果显示(图4)，经过130 d的富集培养，各反应器微生物的量明显提升，细菌16S rRNA拷贝数由初始的1.04×107copies/ng DNA 分别提高到1.34×107 copies/ng DNA (对照组R1)、2.73×107 copies/ng DNA(试验组R2)和3.63×107copies/ng DNA (试验组R3); R2、R3中丰度显著高于R1 (p < 0.05)。由于进水中不含有机碳源，且严格限氧，反硝化微生物受到抑制，相关的功能基因napA (编码周质硝酸盐还原酶)、narG (编码膜结合硝酸盐还原酶)、nirK (编码铜型亚硝酸还原酶)、nirS (编码细胞色素cd1型亚硝酸还原酶)的丰度显著降低。接种污泥中基因narG、napA、nirS、nirK丰度分别为1.01×106、3.16×105、4.71×106、1.01×107 copies/ng DNA，经过130 d的富集培养，其在反应器中丰度分别降至6.86×103 ~ 8.65×103、1.96×104 ~ 4.24×104、1.47×104 ~ 6.01×104、2.70×104 ~ 5.35×104copies/ng DNA，反应器R1、R2、R3间无显著差异。此外，接种污泥中氨单加氧酶编码基因amoA丰度为5.05×103 copies/ng DNA，富集培养130天后，反应器中amoA基因拷贝数为2.49 ~ 2.90×102 copies/ng DNA。
随着污泥的富集培养，厌氧氨氧化成为反应器主要的脱氮途径，相应的，厌氧氨氧化菌16S rRNA和功能基因hzsB丰度显著增加。富集培养130 d后，R2、R3中Anammox 16S rRNA丰度分别为6.96×106、8.47×106 copies/ng DNA，显著高于对照组R1中丰度(p < 0.05)。
联氨合成酶为厌氧氨氧化菌的重要功能蛋白，其编码基因hzsB丰度经富集培养过程也明显提高;130 d时，对照组R1中hzsB丰度为6.83×106 copies/ng DNA，而试验组R2、R3中其丰度分别为9.86×106、1.24×106 copies/ng DNA，显著高于对照组R1(p < 0.05)。可以推测，铁离子对厌氧氨氧化菌富集具有一定促进作用，同时提高了厌氧氨氧化活性，也与反应器脱氮效能结果一致。
2.4微生物群落结构变化
接种污泥及富集培养130 d后各反应器污泥微生物群落结构如图5所示。接种污泥为反硝化污泥，由图5(a)可见变形菌(Proteobacteria)和绿弯菌(Chloroflexi)为其优势菌门，分别占比44.08%和19.11%;富集培养过程中微生物菌群结构显著改变，Proteobacteria菌丰度分别降至31.72% (R1)、30.74% (R2)、30.52% (R3)。绿弯菌(Chloroflexi)相对丰度无明显变化，而厌氧氨氧化菌所属浮霉菌(Planctomycetes)丰度明显提高，由接种污泥中的0.20%提高至5.10% (R1)、7.31% (R2)、9.54% (R3)，试验组中富集程度较高。
图5(b)为污泥微生物属水平热图。可以看出，厌氧氨氧化菌Candidate Brocadia明显富集;接种污泥中Candidate Brocadia菌难以检测其丰度(< 0.01%)，经130 d的富集培养，对照组R1污泥样品中厌氧氨氧化菌Candidate Brocadia相对丰度为4.2%，而试验组R2、R3污泥样品中其丰度分别为6.8%、8.2%，高于对照组R1。
3结论
(1)进水添加铁离子富集培养厌氧氨氧化污泥过程中，试验组R2、R3与对照组R1中呈现类似的规律性，而试验组可承受容积氮负荷显著高于对照组。稳定阶段，试验组R2、R3容积氮去除速率分别为495.6、602.4 mg-N/(L˙d)，为对照组R1的1.20和1.46倍。进水添加铁离子提高了反应器容积氮负荷及运行效能。
(2)进水添加铁离子富集培养厌氧氨氧化污泥130 d后，污泥群落结构及功能基因丰度显著变化。反硝化功能基因narG、napA、nirS、nirK丰度显著降低，厌氧氨氧化菌及微生物量富集明显。试验组R2、R3中厌氧氨氧化菌Candidate Brocadia相对丰度为6.8%、8.2%，明显高于对照组R1(4.2%)。
来源:净水技术 作者:毛念佳等
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